Producerea și caracterizarea biochimică a lacazei NRC 620 din ciupercile oyster și evaluarea eficienței acesteia în clarificarea sucului de mere.

După 25 de zile de incubare statică la 28°C, lacaza de la *Pleurotus ostreatus* NRC620 a prezentat cea mai mare activitate în mediul de cultură fungică. Valorile optime ale pH-ului și temperaturii pentru această enzimă au fost de 3,0 și respectiv 70°C. După 2 ore de incubare la 40°C și 50°C, activitatea enzimatică s-a menținut la 68,33%, respectiv 59,61%. După 2 ore de incubare în tampon citrat-fosfat (pH 7,0), activitatea enzimatică a rămas la 100%. Adăugarea de 10 mM MgSO₄ și CuSO₄ a crescut activitatea enzimatică cu aproximativ 21%, respectiv 35%, în timp ce NaCl, MnCl₂, KCl și CaCl₂ au inhibat activitatea enzimatică. Folosind ABTS ca substrat, parametrii cinetici (Km și Vmax) ai lacazei *Pleurotus ostreatus* NRC 620 au fost 1,99 mM și respectiv 16.217 μmol min−1 L−1. Tratamentul enzimatic al probelor de suc de mere a redus semnificativ atât pH-ul, cât și vâscozitatea, iar această reducere a fost corelată cu o creștere a timpului de depozitare. Tratamentul cu lacază a dus la o ușoară scădere a conținutului total de fenoli din sucul de mere, dar nu s-a observat nicio reducere a activității antioxidante.
În ultimii ani, cercetătorii s-au concentrat pe aplicarea biotehnologiei verzi în industria alimentară. Lacaza este una dintre cele mai utile enzime din industria alimentară, găsind aplicații în domenii precum procesarea sucurilor, panificație, stabilizarea vinului și îmbunătățirea calităților organoleptice ale produselor alimentare.¹Multe plante superioare și microorganisme secretă lacază,²și ciuperci precum deuteromicetele, ascomicetele și bazidiomicetele pot produce, de asemenea, lacază.³Lacaza (EC 1.10.3.2) este o oxidază albastră care reduce oxigenul molecular la apă folosind un sistem format din trei atomi de cupru diferiți, oxidând astfel diverși compuși fenolici și amine aromatice. În timpul producției de sucuri de fructe și legume, brunificarea enzimatică și neenzimatică este o problemă critică.⁴Deoarece aceste substanțe afectează negativ culoarea, aroma și gustul sucului, ele trebuie îndepărtate.⁵
Dintre toate fructele, merele sunt cele mai consumate la nivel mondial și în Uniunea Europeană. În 2019, producția de mere s-a clasat pe locul trei la nivel global, depășind 87 de milioane de tone.⁶Merele conțin numeroși compuși fenolici, inclusiv flavonoide și acizi fenolici, cum ar fi acidul cafeic și acidul clorogenic.⁷Deoarece sucul de mere este de obicei consumat în forma sa limpede, aproximativ 50% până la 90% din componentele fenolice se pierd în timpul procesului de filtrare.⁸Astăzi, consumatorii tind să aleagă produse minim procesate, cum ar fi sucul de mere tulbure, cu un conținut ridicat de polifenoli. Cu toate acestea, datorită conținutului său ridicat de fenoli, acest tip de suc de mere este deosebit de susceptibil la decolorare și înnegrire a pielii.⁹Diverse tehnologii, inclusiv metode de tratament termic, cum ar fi pasteurizarea la 60–90°C, sunt utilizate pentru a reduce sau preveni înnegrirea sucului de mere.¹⁰Cu toate acestea, potrivit cercetărilor lui Sauceda-Gálvez¹¹, prelucrarea termică poate distruge substanțele chimice volatile și poate afecta calitățile organoleptice ale sucului de mere. Alternativele la metodele de prelucrare termică includ dioxidul de carbon supercritic, radiațiile ultraviolete, ultrasunetele, presiunea hidrostatică ridicată sau omogenizarea la presiune înaltă.¹²Eficiența acestor tehnologii și producția de sucuri de fructe adecvate depind de parametrii utilizați și de caracteristicile produsului. Utilizarea lor pe scară largă este limitată de costurile ridicate, efectele adverse asupra calității unor produse alimentare sau inactivarea inadecvată a enzimelor.^13,14
Lacaza poate fi utilizată pentru stabilizarea și clarificarea sucului de fructe.¹⁵Gökmen și colab.¹⁶recomandă utilizarea lacazei pentru clarificarea sucului de fructe, deoarece îndepărtează eficient compușii fenolici prin transformarea lor în polimeri sau oligomeri care sunt ușor de îndepărtat prin orice membrană de ultrafiltrare, permițând sucului de mere să își mențină o culoare și o claritate stabile timp de până la șase săptămâni la 50°C. Lacaza purificată *Trichoderma* a fost imobilizată pe sfere de alumină și utilizată pentru a îndepărta selectiv compușii cu aromă neplăcută cauzați de contaminarea microbiană a sucului de mere.¹⁷
Aproximativ 80-90% dintre componentele volatile ale sucului de mere sunt esteri și aldehide, care conferă sucului o aromă unică.¹⁸Laccaza de la *Trametes versicolor* a fost imobilizată pe un suport ieftin, fabricat din fibre naturale din coji tinere de nucă de cocos, pentru clarificarea sucului de mere.¹⁹Studiile anterioare au investigat stabilizarea sucului de mere (culoare și turbiditate) folosind metode fără enzime sau de imobilizare, sau în combinație cu ultrafiltrarea.^5,19Cu toate acestea, efectul lacazelor fungice asupra proprietăților fizico-chimice ale sucului de mere în timpul depozitării rămâne neclar. Prin urmare, scopul acestui studiu a fost de a investiga experimental modificările proprietăților fizico-chimice, conținutului de compuși fenolici și activității antioxidante a sucului de mere după tratamentul cu lacaze fungice și depozitare la frigider timp de două săptămâni. Lacazele au capacitatea de a oxida compușii fenolici, ceea ce le face promițătoare pentru utilizarea în diverse procese industriale, inclusiv pentru clarificarea sucului. Acest studiu a examinat lacazele de la *Pleurotus ostreatus* NRC 620, concentrându-se pe condițiile ideale pentru activitatea și eficacitatea lor în clarificarea sucului. Deși cercetarea asupra ciupercilor oyster (P. ostreatus NRC 620) este încă limitată, studiile anterioare au examinat enzime din diverse surse fungice, cum ar fi Trametes versicolor și Ganoderma lucidum. Scopul acestui studiu a fost de a evalua potențiala aplicare a acestei enzime în industria alimentară și de a evidenția proprietățile sale unice, în special pH-ul și temperatura ideale.
Acidul 2,2′-azooxibis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonic) (ABTS) a fost achiziționat de la Sigma-Aldrich (Canada). Toți ceilalți reactivi au fost de calitate analitică.
Centrul de Colectare a Culturilor Microbiene al Centrului Național de Cercetare a obținut tulpina cunoscută de ciupercă oyster NRC620. După subcultură, această tulpină a fost depozitată pe plăci înclinate de agar cu dextroză de cartofi la 4°C. Metoda de preparare a inoculului a fost următoarea: miceliul complet dezvoltat, în vârstă de 10 zile, a fost inoculat pe plăci de agar cu dextroză de cartofi și incubat la 28°C. După 10 zile, trei blocuri miceliale cu diametrul de 12 mm au fost îndepărtate din mediul de agar folosind un perforator metalic steril și plasate în baloane Erlenmeyer de 250 ml cu dopuri de bumbac conținând 50 ml de mediu de cultură sterilizat (pH 5,0, așa cum s-a descris anterior de Othman și colab.²⁰Culturile au fost incubate la 28°C timp de 18 zile. Culturile au fost apoi filtrate prin hârtie de filtru Whatman nr. 1, iar supernatantul rezultat a servit drept sursă de enzimă.
Activitatea lacazei a fost determinată utilizând ABTS ca substrat. Amestecul de reacție (2 mL) conținea 500 μL de ABTS 0,3 mM (dizolvat în tampon citrat de sodiu 0,1 M, pH 4,5) și cantitatea necesară de probă enzimatică diluată cu apă distilată.^21,22Având în vedere că lacaza poate oxida ABTS la temperatura camerei (28 °C ± 2), oxidarea ABTS a fost determinată prin măsurarea creșterii absorbanței la 420 nm (ε₄₂₀= 36.000 cm^-1 M ^-1) utilizând un spectrofotometru UV Agilent Carry-100. O unitate de activitate a lacazei a fost necesară pentru a oxida 1 μmol ABTS pe minut. Concentrația de proteine ​​a fost determinată prin metoda Bradford, utilizând albumină serică bovină ca și control intern.^23,24
După obținerea enzimei din tulpina de ciupercă oyster NRC 620, activitatea acesteia a fost măsurată la diferite intervale de cultivare timp de 25 de zile în condiții statice la 28 °C.
Pentru a studia efectul temperaturii asupra activității lacazei, experimentele au fost efectuate în intervalul de temperatură de la 20 la 90 °C. Înainte de adăugarea enzimei și de începerea reacției, tamponul (citrat de sodiu 0,1 M, pH 4,5) și substratul (ABTS) au fost amestecate și incubate timp de 5 minute la diferite temperaturi. Stabilitatea termică a enzimei a fost evaluată prin incubare în tampon fosfat de sodiu 0,05 M (pH 7,0) la 40, 50, 60 și respectiv 70 °C timp de 2 ore. Activitatea reziduală a fost apoi evaluată utilizând substratul ABTS.
Efectul pH-ului asupra activității lacazei a fost evaluat utilizând ABTS ca substrat în tampoane citrat-fosfat 0,1 M cu un interval de pH de la 2,5 la 7,0. Soluția enzimatică a fost incubată la 40°C timp de două ore în tampoane citrat și Tris 0,1 M (pH 3, 4, 6 și 7) pentru a evalua stabilitatea pH-ului. Activitatea reziduală cu ABTS ca substrat a fost calculată după incubare.
Lacaza a fost incubată timp de 10 minute în tampon fosfat de sodiu (0,05 M, pH 7,0) conținând diverși ioni metalici (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ și Mn2+) la concentrații de 2,5 mM și respectiv 10 mM. Substratul (ABTS) a fost apoi adăugat pentru a iniția reacția, iar activitatea relativă a fost evaluată.
Oxidarea ABTS de către lacază la diferite concentrații (0,025–3 mM) a fost măsurată la pH 4,5 pentru a determina parametrii cinetici (Vmax și Km). Parametrii cinetici^constanteConstantele cinetice au fost calculate folosind un grafic Lineweaver-Burk, care reprezintă reciproca vitezei de reacție în funcție de concentrația substratului. Constantele cinetice au fost calculate din graficul Lineweaver-Burk folosind software-ul GraphPad Prism versiunea 6.01.
După spălarea temeinică a merelor cu apă de la robinet, acestea au fost tăiate în jumătate și storse folosind un storcător de mere complet automat Braun MP80 (fabricat în Germania). Sucul a fost filtrat prin patru straturi de tifon. Nu s-au adăugat enzime grupului de control, în timp ce 2,0% lacază (cea mai eficientă concentrație testată) a fost adăugată la sucul de mere proaspăt preparat, care a fost apoi depozitat la 4°C timp de două săptămâni.
Aciditatea titrabilă (AT) și pH-ul au fost determinate conform metodei Boulton și colab.^al.27PH-ul fiecărei probe a fost măsurat folosind un pH-metru digital (pH-metru JENWAY 3510). Aciditatea titrabilă (AT) a fost calculată pe baza acidului malic folosind următoarea formulă.
Unde V și C sunt volumul (mL) și respectiv concentrația (0,1 mol/L) soluției de hidroxid de sodiu utilizată în titrare. K este coeficientul de conversie al acidului malic, egal cu 0,067, iar W este masa (g) sucului de mere.
Totalul solidelor solubile (^TDSConținutul de ) al tuturor probelor de suc a fost determinat utilizând un refractometru de buzunar PAL-1 (ATAGO, Tokyo, Japonia). După fiecare măsurare, lentila optică a fost clătită cu apă deionizată, iar fiecare probă de suc de mere a fost testată de trei ori. Valoarea pentru fiecare probă a fost calculată prin media celor trei măsurători. Media ± deviația standard pentru fiecare probă de suc de mere a fost, de asemenea, calculată prin media acestor rezultate.
Vâscoelasticitatea probelor de suc de mere a fost evaluată utilizând un viscozimetru rotativ (RV, Rheotest 2, Germania). Proba a fost plasată în interiorul cilindrului „S2” al viscozimetrului. Vâscozitatea aparentă a fost reprezentată de panta curbei tensiunea de forfecare în funcție de viteza de forfecare, care a fost calculată din tensiunea de forfecare și curbele corespunzătoare la diferite viteze de forfecare (de la 1,00 la 437,4 s⁻¹). Formula pentru calcularea vâscozității aparente este următoarea:
Unde η este vâscozitatea aparentă (cP), τ este tensiunea de forfecare (dyn/cm²), γ este rata de forfecare (sec⁻¹), iar (τ) se calculează folosind valorile cuplului (α) și ale cilindrului (Z) folosind următoarea formulă: τ = Z . α.
Indicele de brunificare a fost determinat conform metodei Meidav ​​și^al.29O probă de suc de 10 ml a fost centrifugată la 2750 xg timp de 10 minute. 5 ml din supernatantul de suc au fost amestecați cu 5 ml de etanol 95%. Absorbanța amestecului a fost măsurată la 420 nm utilizând un spectrofotometru UV Shimadzu (UV-1601 PC).
Conținutul total de compuși fenolici (TPC) a fost determinat colorimetric utilizând reactivul Folin-Ciocalteu, așa cum este descris de Boulton și colab.^[27]. O curbă standard a acidului galic a fost construită pentru concentrații de la 0 la 500 mg/L (^r²= 0,997). Rezultatele sunt exprimate ca echivalenți de acid galic (mg GAE/mL).
Adăugați 125 μL de apă distilată și 2850 μL de soluție FRAP la 25 μL de suc de mere și lăsați amestecul la întuneric timp de³⁰min. Apoi, măsurați absorbanța la 593 nm utilizând un spectrofotometru UV Shimadzu (UV-1601 PC). Reactivul FRAP a fost preparat prin amestecarea a 300 mM tampon acetat (pH 3,6), 20 mM clorură de fier(III) și 10 mM 2,4,6-tris(2-piridil)triazină (TPTZ) (dizolvată în 40 mM HCl) într-un raport de 10:1:1. O curbă standard a fost generată utilizând Trolox ca standard (^R²= 0,999), iar rezultatele sunt exprimate în μM Trolox/mL.
Activitatea antioxidantă a sucurilor tratate și netratate a fost determinată utilizând metoda DPPH pentru a evalua capacitatea acestora de a elimina radicalii liberi DPPH.³¹Zece microlitri de suc au fost amestecați cu 1 ml de soluție DPPH (100 μM) în metanol. După reacția la întuneric timp de 30 de minute, absorbanța amestecului a fost măsurată la 517 nm utilizând un spectrofotometru UV Shimadzu (UV-1601 PC). Rezultatele au fost exprimate ca echivalenți trolox (μM trolox/ml) pe baza unei curbe de calibrare (_^R2= 0,990).
Datele obținute au arătat că producția maximă de lacază a fost observată la ciupercile oyster NRC 620 până la sfârșitul celei de-a 18-a zile de fermentație, atingând o activitate de 1302 U/L. Aceasta a servit drept bază pentru determinarea timpului optim de cultivare pentru producerea de lacază (Figura 1). Deși producția de enzime a crescut odată cu creșterea timpului de cultivare, rata de creștere nu a fost direct proporțională cu timpul de cultivare; după 21 de zile, activitatea enzimatică a crescut cu doar 90 U/L (până la 1390 U/L). Prin urmare, în cele din urmă, 18 zile au fost selectate ca timp optim de cultivare pentru a echilibra randamentul produsului cu beneficiile economice ale creșterii timpului de cultivare.
Efectul timpului de cultivare asupra randamentului de lacază la Pleurotus ostreatus NRC 620. Trei blocuri miceliale fungice (12 mm) au fost inoculate în 50 ml de mediu steril și apoi cultivate la 28 °C pentru perioade diferite.
În concordanță cu alte studii, rezultatele noastre indică faptul că perioada ideală de cultură pentru a atinge secreția maximă de lacază de către fungi este probabil între 7 și 36 de zile.³²Conform lui Ezike și colab.³³*Trametes polyzona* WRF03 a produs cea mai mare cantitate de lacază până la sfârșitul celei de-a noua zile de fermentație, cu o activitate specifică de 1637 U/mg proteină. În plus, Othman și colab.³⁴s-a constatat că *Trichoderma harzianum* S7113 a secretat o cantitate mare de lacază în a cincea zi de cultură. Rata de producție a lacării a atins un vârf de activitate în a paisprezecea zi, apoi a scăzut treptat.³⁴Deși secreția enzimatică poate apărea și în timpul fazei principale de creștere, aceasta atinge de obicei vârful în timpul fazei intermediare și este declanșată de consumul unei surse de carbon sau azot.^34,35
Deși lacaza de la Pleurotus ostreatus NRC 620 a prezentat o activitate ridicată pe un interval larg de temperatură, de la 50°C la 80°C, apropiindu-se de activitatea maximă (69–98%), activitatea sa maximă a fost observată la 70°C (Fig. 2a). În afara acestui interval de temperatură, activitatea enzimatică a scăzut la aproximativ 70°C. Aceste rezultate sugerează că enzima este activă la temperaturi ridicate, probabil deoarece temperatura ridicată crește energia cinetică a reacției.
Efectul temperaturii de reacție (a) și al pH-ului (b) asupra activității lacazei în *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperaturi cuprinse între 20 și 90 °C au fost atinse prin preincubarea amestecului la diferite temperaturi timp de 5 minute înainte de adăugarea enzimei și începerea reacției. Efectul pH-ului asupra activității lacazei a fost evaluat utilizând ABTS ca substrat în soluții conținând tampon citrat-fosfat 0,1 M pe un interval de pH de 2,5 până la 7,0.
Conform lui Ezike și^al.33, temperatura optimă pentru lacaza *Trametes polyzona* WRF03 este de 55 °C, aceeași cu cea pentru *Ganoderma lucidum*^laccase36și similară cu temperatura optimă (50 °C) pentru *Trametes polyzona* KU-RNW02737^lacază . ^Baldrian38observă că, la fel ca în cazul altor sisteme enzimatice care degradează lignina, intervalul de temperatură ideal pentru lacază este între 50 și 70 °C.
Rezultatele au arătat că enzima a prezentat cea mai mare activitate la pH 3,0, atingând 94% activitate la pH 3,5. Cu toate acestea, a rămas activă pe un interval larg de pH de la 2,5 la 7,0 (Figura 2b). În plus, a prezentat o activitate mai mare în condiții acide comparativ cu condițiile neutre sau alcaline. Activitatea sa a rămas la cel puțin 77% pe intervalul de pH de la 2,5 la 4,5, dar a atins doar aproximativ 38% la pH 7,0. PH-ul optim pentru lacaza de la *Trametes polyzona* WRF03 a fost 4,533, care este același cu pH-ul pentru lacazele de la *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 și *Trametes hirsuta* 41. Cu toate acestea, conform studiului realizat de Chairin și colab.⁴², pH-ul optim pentru lacaza de la *Polymorpha f. sp.* WR710-1 este 2,2, în timp ce pH-ul optim pentru lacaza de la *Polymorpha f. sp.* IBL-04 este 5,043. Legarea anionilor de hidroxid (inhibitor de lacază) la atomii de cupru ai lacazei T2/T3 poate fi motivul activității scăzute a lacazei în condiții de pH neutru sau alcalin. Acest lucru poate perturba transferul intern de electroni de la centrul T1 la centrul T2/T3, astfel^limitareactivitatea enzimatică23,44
Prin incubarea enzimei la diferite temperaturi, s-a constatat că atât timpul de incubare, cât și temperatura au afectat stabilitatea enzimei. În mod notabil, lacaza de la *Trametes polyzona* NRC 620 a prezentat o stabilitate mai mare la 40℃ și 50℃, păstrând 68,33%, respectiv 59,61% din activitatea sa inițială, după 120 de minute (Figura 3a). În schimb, în ​​aceleași condiții (40℃ și 50℃, 120 de minute), lacaza de la *Trametes polyzona* WRF03 și-a păstrat 64,38%, respectiv 42,92% din activitate.³³Dimpotrivă, creșterea timpului de incubare și a temperaturii a scăzut stabilitatea lacazei *Trametes polyzona* NRC 620; După incubare la 60℃ și 70℃ timp de 60 de minute, activitatea acesteia a scăzut la 39,24%, respectiv 1,72% (Figura 3a). În concordanță cu rezultatele experimentale, lacaza de la *Trametes polyzona* WRF03 a prezentat o stabilitate mai mare la 40 și 50℃ pe tot parcursul procesului de tratament termic.³³În mod similar, Lueangjaroenkit și^al.37și Chairin și^al.42a raportat stabilitatea lacazelor din Trametes polyzona KURNW027 și Trametes polyzona WR710-1 la 50 °C timp de 1 oră, respectiv. Ca biocatalizator util aplicabil în diverse domenii biotehnologice, lacaza ar trebui să aibă o stabilitate și o performanță bune pe un interval larg de temperatură.
Stabilitatea termostatică (a) și stabilitatea pH-ului (b) ale lacazei de la *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Stabilitatea termostatică a fost evaluată prin incubarea soluției enzimatice în tampon fosfat de sodiu 0,05 M (pH 7,0) la 40, 50, 60 și respectiv 70 °C timp de 2 ore. Stabilitatea pH-ului a fost evaluată prin incubarea soluției enzimatice în tampon citrat 0,1 M și tampon Tris (pH 3, 4, 6 și 7) la 40 °C timp de 2 ore. Activitatea reziduală a fost calculată utilizând ABTS ca substrat după incubare.
Pentru a determina condițiile optime de utilizare și depozitare a enzimelor, am investigat efectul pH-ului asupra stabilității lacazei. Expunerea la diferite valori ale pH-ului a afectat semnificativ stabilitatea structurii proteinei, influențând astfel stabilitatea și activitatea moleculei de enzimă. Rezultatele au arătat că enzima a fost mai puțin stabilă în condiții acide, în timp ce a demonstrat o stabilitate mai bună la valori mai mari ale pH-ului (regiuni neutre și alcaline). La valori ale pH-ului de 7,0, 6,0, 4,0 și 3,0, ratele de retenție a enzimei după 120 de minute au fost de aproximativ 100%, 62,54%, 52,39% și respectiv 11,14% (Fig. 3b). Lacaza *Strombus multisus* WRF03 a prezentat o stabilitate mai mare la valori ale pH-ului neutru (5,5–6,5) și o stabilitate mai mică la valori ale pH-ului acid (sub 4,0). După 120 de minute la valori ale pH-ului de 5,5, 6,0 și 6,5, ratele de retenție a enzimelor au fost de aproximativ 82%, 100% și, respectiv, 93%.³³Khairin și colab.⁴²a observat că lacaza de la Trametes polyzona WR710-1 a fost stabilă în intervalul de pH de 6,0 până la 7,0, în timp ce Sayed și colab.⁴⁵a arătat că lacaza a fost mai stabilă în condiții de pH neutru. Cu toate acestea, lacaza de la Cerrena unicolor a prezentat, de asemenea, stabilitate în condiții alcaline (pH 9,0)⁴⁶Lacazele studiate au demonstrat o stabilitate ridicată pe un interval larg de pH. Aceasta poate fi o caracteristică importantă pentru aplicațiile industriale.
Întrucât unii ioni metalici au atât efecte stimulatoare, cât și inhibitoare asupra activității enzimatice, efectele lor asupra activității enzimatice trebuie luate în considerare în aplicațiile industriale. Acest lucru este crucial deoarece ionii metalici sunt contaminanți comuni de mediu care pot afecta stabilitatea și sinteza enzimelor extracelulare.⁴⁷Pentru a investiga efectele mai multor ioni metalici asupra lacazei de la *Pleurotus ostreatus* NRC 620, am efectuat experimente corespunzătoare. După cum se arată în Figura 4, în funcție de tipul de metal utilizat, creșterea concentrației de ioni metalici de la 2,5 mM la 10 mM a afectat negativ funcția enzimatică. De exemplu,^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺și^Cu²⁺ar putea stimula și activa activitatea enzimatică, în timp ce^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺și^K⁺ar putea inhiba activitatea enzimatică. La o concentrație de 10 mM, ionii de Cu²⁺ și Mg²⁺ au fost cei mai puternici activatori ai activității lacazei de la *Pleurotus ostreatus* NRC 620, oferind un grad de activare de aproximativ 34%, respectiv 20%. Cu toate acestea, la o concentrație de 10 mM, ionii de Ca²⁺ au fost cel mai puternic inhibitor al lacazei, reducând activitatea enzimatică cu aproximativ 60%.
Efectul ionilor metalici asupra activității lacazei Pleurotus ostreatus NRC 620. Lacaza a fost incubată timp de 10 minute în tampon fosfat de sodiu (0,05 M, pH 7,0) conținând diverși ioni metalici la concentrații de 2,5 mM și 10 mM. Reacția a fost apoi inițiată prin adăugarea substratului (ABTS), după care a fost măsurată activitatea relativă.
Rezultatele noastre sunt în concordanță cu cele ale altor autori care au descoperit că Mg²⁺ și Cu²⁺ sporesc activitatea *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño și colab.⁴⁸ au descoperit că lacaza de la *Xylaria* sp. este stimulată într-o oarecare măsură de ionii de cupru (Cu²⁺). În plus, Foroutanfar și colab.⁴⁹ și Si și colab.⁵⁰ au efectuat studii similare asupra lacazelor de la *Paraconiothyrium variabile* și, respectiv, *Trametes pubescens*. Situsul de legare a cuprului de tip II (T2) al acestei enzime poate fi saturat cu Cu²⁺ la o concentrație dată, ceea ce poate explica stimularea activității lacazei la concentrații mai mari de Cu²⁺³⁹. Întrucât lacazele fungilor de putregai alb sunt oxidaze care conțin mai mulți atomi de cupru, efectele ionilor de cupru asupra activității lacazei sunt diverse și variază de la stimulatoare și inhibitoare la neutre.⁵¹ În schimb, Zhou și colab.^[52]a raportat că^Cu²⁺a inhibat activitatea lacazei termitei subterane din Taiwan (Odontotermes formosanus). Cu toate acestea, lacazele de Cerena sp. HYB07^[53]și Clitocybe maxima^[54]nu au fost afectate de ionii de cupru.
Specificitatea substratului a fost reprezentată de parametrii săi cinetici (Km și Vmax); cu cât afinitatea de legare a substratului la enzimă este mai mare, cu atât valoarea Km este mai mică și specificitatea substratului este mai mare.^3,21,55Parametrii cinetici (Km și Vmax) ai lacazei de la *Pleurotus ostreatus* NRC 620 au fost determinați folosind software-ul GraphPad Prism 6.0 prin reprezentarea graficului Lineweaver-Burk (Figura 5). Când s-a folosit ABTS ca substrat, rezultatele au fost 1,99 mM și 16217 μmol^{min⁻¹ L⁻¹,}respectiv. Elsayed și colab.²¹au raportat că valorile Km pentru oxidarea ABTS au fost de 0,1 mM și respectiv 0,064 mM, indicând o afinitate ridicată a izoenzimelor Lac A și Lac B pentru ABTS. În plus, valorile Vmax au fost de 0,182 μmol^min⁻¹și 0,603 μmol^min⁻¹, respectiv. Valoarea Km obținută a fost mai mică decât cea a Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); în plus, valoarea lor Vmax (1429 mmol min⁻¹) a fost, de asemenea,^{mai jos}atunci când se utilizează ABTS ca substrat.33 În mod similar, valorile Km ale concentrațiilor de lacază din Lentinus squarrosulus MR13 și Trametes sp. AH28-2 au fost de 0,0714 mM și respectiv 0,025 mM, iar valorile Vmax au fost de 0,0091 mM min−1 și 0,67 mM min−1 mg−1 (față de ABTS).^{, respectiv.56,57}
A fost investigat efectul concentrației de ABTS asupra activității lacazei din *Pleurotus ostreatus* NRC 620 și a fost reprezentat grafic un grafic Lineweaver-Burk al reciprocului vitezei inițiale de reacție în funcție de concentrația de ABTS. Reacția de oxidare a ABTS cu diferite concentrații (0,025–3,0 mM) de lacază a fost măsurată la pH 4,5 pentru a determina parametrii cinetici (Vmax și Km). Constantele cinetice Michaelis-Menten au fost calculate folosind graficul Lineweaver-Burk al reciprocului vitezei de reacție în funcție de concentrația substratului. Constantele cinetice au fost calculate din graficul Lineweaver-Burk folosind software-ul GraphPad Prism 6.01.
Enzimele tradiționale de clarificare, cum ar fi pectinazele, hidrolizează substanțele pectice, reducând vâscozitatea și turbiditatea. Acestea descompun eficient polizaharidele structurale și sunt adesea utilizate în combinație cu alte enzime, cum ar fi celulazele și hemicelulazele, pentru a îmbunătăți randamentul și claritatea. Cu toate acestea, pectinazele nu vizează în mod specific compușii fenolici, care sunt principalii contribuitori la turbiditate și brunificare oxidativă, în special în sucuri precum cele de mere și struguri.⁵⁸În schimb, lacazele catalizează oxidarea compușilor fenolici, polimerizându-i în molecule mai mari, insolubile, care pot fi îndepărtate prin sedimentare sau filtrare. Acest mecanism nu numai că îmbunătățește claritatea, dar prelungește și durata de valabilitate a sucului prin reducerea probabilității de rumenire oxidativă cauzată de compușii fenolici. În plus, procesele de clarificare pe bază de lacaze pot fi efectuate în condiții de procesare blânde (pH 3,5–5,5, temperatură 25–40 °C), ceea ce le face potrivite pentru sucurile delicate, fără a compromite proprietățile lor nutriționale sau organoleptice.⁵⁹Studiile au arătat că tratamentul cu pectinază poate clarifica sucul în 1-2 ore, în timp ce tratamentul cu lacază necesită de obicei un timp de reacție mai lung (3-6 ore) pentru a reduce complet compușii fenolici. Cu toate acestea, acest proces poate fi optimizat prin imobilizarea enzimei sau prin combinarea lacării cu metode mecanice de clarificare.⁶⁰În acest studiu, profilarea enzimatică a extractului brut a relevat activități semnificative ale lacazei și α-amilazei, în timp ce activitățile pectinazei și xilanazei au fost extrem de scăzute, iar activitatea celulazei nu a fost detectată. Prin urmare, reducerea turbidității și a conținutului fenolic s-a datorat în principal acțiunii lacazei, în timp ce modificarea vâscozității ar putea fi parțial datorată acțiunii amilazei.
Tabelul 1 prezintă parametrii fizico-chimici ai sucului de mere proaspăt stors și ai probelor tratate cu lacază. Rezultatele au arătat că randamentul sucului de mere proaspăt stors (71,59%) a fost mai mic decât cel al probelor tratate cu lacază (87,34%). Aceste rezultate sunt în concordanță cu descoperirile lui Pilnik și Orange.⁶¹, care a indicat că utilizarea enzimelor în procesarea fructelor poate crește randamentul sucului, poate îmbunătăți filtrarea și poate obține un suc limpede de înaltă calitate, pentru concentrare. Creșterea randamentului sucului se datorează în principal creșterii conținutului de zaharuri solubile din suc. În timpul hidrolizei enzimatice a fructelor, mezoglea și pectina din pereții celulari ai produsului sunt distruse și transformate în substanțe solubile, cum ar fi zaharurile și acizii neutri.^62.Valoarea pH-ului sucului de mere tratat cu enzime a fost semnificativ mai mică decât cea a grupului de control (P < 0,05), iar valoarea pH-ului ambelor grupuri a crescut semnificativ în timpul depozitării (Tabelul 1). Aceste rezultate sunt în concordanță cu cele ale lui Mark și colab.⁶³, care au observat că pH-ul sucului de fructe de caju a scăzut după depozitare, în urma tratamentului termic. Degradarea pectinei și formarea acidului galacturonic după tratamentul enzimatic pot fi responsabile pentru creșterea pH-ului în timpul depozitării. PH-ul probelor tratate cu enzime a rămas între 4,05 și 4,31 pe tot parcursul depozitării, în timp ce pH-ul sucului de mere netratat a variat între 4,12 și 4,33.
Aciditatea totală (AT) atât a probelor netratate, cât și a celor tratate cu lacază a prezentat o tendință de scădere odată cu creșterea timpului de depozitare (Tabelul 1). Scăderea acidității a fost atribuită conversiei acizilor organici în carbohidrați sau reacțiilor enzimatice, precum și oxidării în timpul depozitării sucului.⁶⁴Aciditatea totală a sucului de mere de control și a probelor tratate cu enzime a fost mai mică decât cea a altor sucuri (suc de căpșuni 0,9%, suc de prune 2,2%, suc de kumquat 1,0%, suc de caise 2,4%, suc de portocale 0,8%), dar similară cu cea a altor sucuri (de exemplu, suc de pere 0,3%).⁶²Aceste diferențe în sucul de mere proaspăt stors netratat se pot datora diverșilor factori, cum ar fi condițiile de creștere, factorii genetici, nivelul de maturitate și metodele de procesare.⁶⁵Scăderea acidității totale a sucului de mere de control și a celui tratat cu lacază este în concordanță cu rezultatele prezentate de Singh și colab.⁶⁶privind scăderea acidității totale a sucului de mere Jin Nuo după 74 de zile de depozitare. Pe de altă parte, Oshmiansky și Wojdylo⁶⁷nu au găsit modificări semnificative ale acidității sucului de mere atunci când au studiat efectul metodelor tradiționale de clarificare.
Rezultatele prezentate în Tabelul 1 indică faptul că valoarea solidelor totale solubile (TSS) din sucul de mere tratat cu lacază a fost mai mare decât cea a probei netratate. Aceste rezultate sunt în concordanță cu studiile publicate.^{. 68}În plus, Tabelul 1 arată că valoarea TSS a grupului de control cu ​​suc de mere a fost de 9,58 la momentul inițial și a atins 11,05 la sfârșitul perioadei de depozitare. Aceste valori sunt mai mici decât valorile TSS ale sucului proaspăt de mere raportate de Hamid și colab.^{. 69}(11,2 și, respectiv, 11,80). Valoarea TSS a probelor de suc de mere tratate cu lacază a crescut semnificativ, începând de la 11,23 și ajungând la 12,93 după două săptămâni de depozitare la 4°C (Tabelul 1). O creștere similară a TSS în timpul depozitării a fost observată și la citrice, lămâi și portocale dulci. Creșterea solidelor totale solubile (TSS) în timpul depozitării se poate datora hidrolizei polizaharidelor (amidon) în monozaharide (zaharuri), creșterii concentrației datorate deshidratării sucului și degradării pectinei din suc în solide solubile. Creșterea solidelor totale solubile (TSS) se datorează probabil creșterii zaharurilor solubile, care pot fi formate prin conversia pectinei sau celulozei în zaharuri solubile de către pectină sau celulază, respectiv, sau prin hidroliza amidonului în zaharuri, așa cum a raportat Hamed și colab.^69.Efectul lacazei asupra proprietăților sucului de mere poate fi observat vizual, deoarece sucul de mere tratat cu lacază prezintă o curgere mai bună și o vâscozitate mai mică decât sucul netratat. Această observație este înregistrată în Tabelul 1; Vâscozitatea probei tratate cu enzime a fost de 1,87 cP, în timp ce vâscozitatea probei de control a fost de 2,95 cP. Această scădere semnificativă a vâscozității se datorează probabil capacității mai mari de reținere a apei a substanțelor asemănătoare pectinei și formării unei structuri de rețea coezive.
În acest studiu, efectul lacazei asupra indicelui de brunificare (BI) al sucului de mere a fost investigat prin măsurarea absorbanței la 420 nm folosind un spectrofotometru. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 1. În timpul depozitării, BI al probelor de suc de mere, atât în ​​grupul tratat, cât și în cel netratat, a prezentat o tendință de creștere treptată. BI reflectă gradul de brunificare și poate servi drept^{un important}indicator al reacțiilor de brunificare enzimatice și non-enzimatice. Absorbanța a crescut semnificativ în timpul depozitării (P < 0,05). La sfârșitul depozitării,_A420Valoarea probelor de suc de mere din grupurile de control și tratate cu enzime a crescut cu aproximativ 217%, respectiv 121% (Tabelul 1). Rezultatele indică faptul că tratamentul enzimatic poate reduce eficient gradul de rumenire cu aproximativ 56%. Rezultatele lui Bezerra și colab.^[19] sunt în concordanță cu rezultatele noastre; Au folosit lacază-glutaraldehidă-fibră de cocos pentru a clarifica sucul de mere, reducându-i culoarea originală cu 61%.
Deși polifenolii din sucurile de fructe au efecte nutriționale și terapeutice pozitive asupra organismului uman, aceștia pot reacționa și cu proteinele, provocând tulburarea, sedimentarea sau turbiditatea sucului, modificând astfel aroma și gustul produsului și reducându-i durata de valabilitate.⁷¹Scopul acestui studiu a fost de a reduce în siguranță conținutul de compuși fenolici din sucul de mere utilizând lacază de la Pleurotus ostreatus NRC 620. Rezultatele prezentate în Tabelul 1 arată că, înainte de depozitare la 4 °C, conținutul total de compuși fenolici a scăzut semnificativ înainte de depozitare. În plus, conținutul total de compuși fenolici a scăzut și în timpul depozitării în ambele probe studiate (Tabelul 1). Cercetări efectuate de Sandri și colab.⁷²a arătat că sucul de mere tratat cu enzime își poate păstra activitatea antioxidantă și conținutul de compuși fenolici. Cu toate acestea, rezultatele unui studiu realizat de Lettera și colab.⁷³arată că tratarea sucului de portocale cu lacază fungică poate reduce conținutul de compuși fenolici din acesta cu până la 45%.
Compușii fenolici s-au dovedit a avea proprietăți precum eliminarea radicalilor liberi, reducerea și stingerea oxigenului singlet, transferul de atomi de hidrogen și donarea de electroni către radicalii liberi, ceea ce îi face antioxidanți puternici.⁷⁴Prin urmare, în acest studiu, s-au utilizat metode bazate pe DPPH și FRAP pentru a evalua efectul lacazei asupra activității antioxidante a sucului de mere păstrat la frigider timp de 14 zile (Tabelul 2). Ambele metode au arătat o creștere a activității antioxidante în timpul depozitării, care se poate datora creșterii compușilor fenolici liberi sau formării produșilor de reacție Maillard (MRP), produșii de reacție Maillard fiind probabil cauza creșterii activității antioxidante.⁷⁵Reacțiile de brunificare neenzimatice (inclusiv degradarea acidului ascorbic, reacțiile Maillard și degradarea catalizată de acid a zaharurilor) produc pigmenți maronii (melanoidine). Produșii intermediari de degradare a acidului ascorbic și produșii de degradare a zahărului (cum ar fi compușii carbonilici) pot reacționa cu aminoacizii prin reacții Maillard.⁷⁶Deși rumenirea fructelor și legumelor în timpul depozitării a fost studiată pe larg, înțelegerea noastră asupra acestor reacții rămâne limitată.⁷⁷Comparativ cu metoda FRAP, sucul de mere tratat cu lacază a prezentat o activitate antioxidantă semnificativ mai scăzută prin metoda DPPH (Tabelul 2), iar activitatea antioxidantă a tuturor probelor a crescut semnificativ odată cu creșterea timpului de depozitare. În acest studiu au fost utilizate două metode diferite pentru determinarea activității antioxidante, deoarece principiile lor diferă. Metoda DPPH măsoară capacitatea de a neutraliza radicalii liberi, în timp ce metoda FRAP măsoară capacitatea de a reduce ionii de fier. Prin urmare, se recomandă utilizarea mai multor metode pentru determinarea activității antioxidante pentru a înțelege mai bine activitatea antioxidantă a probelor studiate.⁷⁸
Una dintre principalele concluzii ale acestui studiu este că laccaza NRC 620 din *Pleurotus ostreatus* prezintă o activitate optimă la 70°C și un pH de 3,0. Comparativ cu alte laccaze fungice utilizate în mod obișnuit pentru clarificarea sucurilor, cum ar fi laccazele *Trametes versicolor* și *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 prezintă o stabilitate termică mai mare și un pH mai acid. Laccazele din *Trametes versicolor* și *Ganoderma lucidum* prezintă de obicei o activitate optimă în intervalul 50-60°C și la valori ale pH-ului între 3,5 și 5,0. Această diferență poate contribui la o eficiență îmbunătățită a clarificării sucurilor, în special pentru sucurile acide, unde stabilitatea la valori mai scăzute ale pH-ului este critică. Caracteristica unică a *P. Comparativ cu alte laccaze fungice studiate, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 prezintă capacitatea de a funcționa eficient în condiții mai dificile. Temperatura sa optimă de activitate mai ridicată sugerează avantaje potențiale în aplicații industriale, cum ar fi rate de reacție mai rapide și contaminare microbiană redusă. PH-ul său scăzut, care este bine adaptat naturii acide a multor sucuri, poate fi util în procesele de clarificare a sucurilor. Aceste rezultate justifică explorări suplimentare pentru aplicații la scară largă, făcând din *Pleurotus ostreatus* NRC 620 o alternativă viabilă la sursele tradiționale de lacază fungică. Comparativ cu studiile anterioare, am constatat că temperatura optimă este de 60°C, iar pH-ul optim este de 3,0. După reacția la 60°C timp de 80 de minute, lacază de *Ganoderma lucidum* a reținut...⁴⁶% din activitatea sa.79 Conform lui Kurniawati și Nicelle⁸⁰Enzimele *Ganoderma lucidum* prezintă o stabilitate excelentă până la moderată la 25°C și valori ale pH-ului cuprinse între 5,0 și 8,0, și stabilitate la pH 6,0 și temperaturi cuprinse între 10 și 30°C. În acest studiu, am constatat că pH-ul și temperatura optime pentru activitatea enzimatică pentru *Pleurotus ostreatus* au fost de 3,0 și, respectiv, 70°C. După incubare la 40°C și 50°C timp de două ore, enzima și-a păstrat 68,33%, respectiv, 59,61% din activitate. În plus, lacaza Pleurotus ostreatus NRC 620 a prezentat o activitate ridicată pe un interval larg de temperatură, de la 50°C la 80°C, atingând aproape activitatea maximă (69%–98%), activitatea maximă fiind observată la 70°C.
În concluzie, lacaza NRC620 din ciupercile stridii, obținută în condiții statice, a demonstrat o activitate și o stabilitate optime într-o gamă de condiții de pH și temperatură, demonstrând o stabilitate superioară în comparație cu alte surse de enzime. Adăugarea a 10 mM MgSO₄ și CuSO₄ a crescut activitatea enzimatică cu aproximativ 21%, respectiv 35%. Când a fost procesată în suc de mere, enzima a redus pH-ul și vâscozitatea, în timp ce conținutul de fenoli a scăzut doar ușor în timpul depozitării.
Rezultatele confirmă potențialul lacazei în industria alimentară, în special în clarificarea băuturilor. Prin descompunerea specifică a compușilor fenolici, lacaza nu numai că reduce turbiditatea și îmbunătățește claritatea, dar menține și calitatea sucurilor de fructe în condiții de operare blânde. Spre deosebire de agenții de clarificare tradiționali, cum ar fi gelatina, bentonita și gelul de silice, lacaza nu generează deșeuri și nu elimină aromele plăcute din băuturi, ceea ce o face o opțiune mai ecologică și mai sustenabilă. În plus, în comparație cu alte enzime și metode de filtrare, lacaza oferă o soluție specifică și rentabilă, fără a compromite calitatea produsului.
Kyomuhimbo, HD și Brink, HG. Aplicații și strategii de imobilizare a lacazelor care conțin cupru; o recenzie. Heliyon 9, e13156 (2023).